干细胞研究进展与应用综述

摘要: 本综述通过举例,简要阐述了近年来干细胞研究进展以及干细胞的应用情况。

关键词:胚胎干细胞;成体干细胞;应用

前言:

干细胞是人体及其各种组织细胞的最初来源,具有高度自我复制、高度增殖和多向分化的潜能。干细胞研究正在向现代生命科学和医学的各个领域交叉渗透,干细胞技术也从一种实验室概念逐渐转变成能够看得见的现实。干细胞研究己成为生命科学中的热点。同时,干细胞的研究对人类的疾病的治疗等也有着其绝对的重要意义。

1 干细胞的分类及其研究进展

干细胞(stem cell)是机体内存在的一类特殊细胞,具有自我更新及多向分化潜能。能根据来源的不同,干细胞可分为胚胎干(embryonic stem cell,ES)细胞、诱导性多潜能干(induced pluripotent stem cells,iPS)细胞及成体干(adult stem cell)细胞。不同种类的干细胞具有各自的优势和不足。胚胎干细胞是由胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体外培养而筛选出的细胞,具有发育全能性,理论上可以诱导分化为机体中200多种细胞。成体干细胞是存在于已经分化组织中的未分化细胞,能够自我更新并特化形成该类型组织的多能细胞。

1.1 ES 细胞 胚胎干细胞是指当受精卵分裂发育成囊胚时内细胞团的细胞,发育等级较高,可以分化为人体的所有体细胞,是全能干细胞。ES 细胞是目前研究最广泛、最成熟的干细胞体系。自 2009 年起,全球共批准了 3项人 ES(hES)细胞的临床试验,标志着 hES 细胞向临床应用迈出了重要的一步。然而,hES 细胞临床应用面临的一个瓶颈问题是免疫排斥反应。体细胞核移植(SCNT)技术能够制备携带患者基因型的 hES 细胞,可解决免疫排斥的难题。2013 年,美国 Mitalipov 研究团队将人类皮肤成纤维细胞核移植到供体去核卵细胞中,成功建立了 SCNT 的hES 细胞[1],标志着治疗性克隆又向前迈出关键性的一步。然而,hES 细胞建系必须摧毁人类早期胚胎,故存在剧烈的伦理学争议。此外,hES 细胞来源的分化细胞移植到体内存在发展为肿瘤的潜在风险。

1.2 iPS 细胞 2006 年Yamanaka 实验室利用 Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc 4 种因子将鼠成纤维细胞重编程为诱导多功能干细胞,标志着一种新型类胚胎干细胞的问世。PsCs诱导的本质是使终末分化的细胞重新获得多能干细胞相似的调控网络和表观遗传学特征,迄今,已建立了大鼠[2, 3]、人[4, 5]、猪[6, 7]、猴[8]、兔[9]和绵羊[10]的iPSs细胞系,并证实具有ES细胞的发育全能性。采用体细胞重编程技术可从患者自体细胞获得的 iPS 细胞,这不但可解决免疫排斥的难题,而且避免了 hES 细胞和 SCNT 研究存在的伦理学争论。近年来,采取非整合的病毒载体、mRNA 转染、小分子化合物化学诱导等方法均可将体细胞重编程为 iPS 细胞[2,3]。这些技术的改进既可避免肿瘤形成和DNA与宿主整合的相关风险,又可降低 iPS 细胞的制备成本,使得大规模制备自体干细胞成为可能。Yamanaka 带领的日本研究团队目前正在建立 iPS 细胞库。2013 年,日本批准了全球首个 iPS 细胞的临床试验。然而,iPS 细胞仍保留其来源细胞的部分记忆,其多潜能性和分化能力存在较大的变异性。

关于 iPSs 的研究日新月异,并取得了突破性的进展。迄今为止,在物种方面,关于小鼠[9]、大鼠[10-11]、人[12-13]、恒河猴[14]、猪的 iPSs 都有研究[15],不过很多还未形成嵌合体;在细胞种类方面,被用于重编程研究的供体细胞有成纤维细胞[9,13]、肾上腺细胞、肌细胞、造血系细胞、角质形成细胞、肠上皮细胞[16]、肝细胞、胃上皮细胞[17]、成熟 B 淋巴细胞[18]、神经干细胞[19]、胰腺 β 细胞(鼠类[20]),成人及新生儿皮肤成纤维细胞[21-22]、包皮成纤维细胞[23]、角质形成细胞[24]、外周血 T 细胞等(人类) [25];在因子导入途径方面,从最早使用的反转录病毒载体[9],发展到慢病毒载体[12],腺病毒载体[26],表达质粒转导的非病毒载体[27],转座子以及细胞穿膜肽等[28-30];在导入因子的数目方面,从 4 种因子[9,12-13,31],减少到 3 种因子[32-33],2 种因子[19,34-35],最后发现只需 1 种因子就能将体细胞重编程为 iPSs[36]。

1.3 成体干细胞 成体干细胞存在于成体组织,包括造血干细胞、脐带血干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞、脂肪干细胞、心肌干细胞等,发育等级较低,是多能或单能干细胞。成体干细胞是存在于机体某个组织或器官中的干细胞,是修复和再生的基础。从自体组织中分离得到的成体干细胞也可解决免疫排斥的难题,并且成体干细胞注入体内后有明显的趋化性,较明显地集中到达损伤部位,在局部微环境的诱导下,可向损伤组织修复所急需的细胞类型分化。对于临床应用而言,既可从易获取的组织中分离患者的自体干细胞,定向分化为所需的细胞类型用于移植,也可直接在体内将干细胞分化为所需的细胞类型,以重建受损器官的功能。然而,成体干细胞在不少组织中的来源存在争议,并且缺乏特异性标志分子,分离、纯化及鉴定比较困难,体外分化能力也存在较大的变异性。

2 干细胞应用

2.1 ES细胞的应用

2.1.1 用于生产转基因动物和克隆动物

利用ES细胞作为载体,体外定向改造ES细胞,使基因的整合数目、位点、表达程度和插入基因的稳定性及筛选工作等都在细胞水平进行,从而获得稳定#满意的转基因ES细胞系,以生产转基因动物。

用ES细胞为细胞核的供体进行核移植后,在短期内可获得大量基因型和表型完全相同的个体。此法明显优于体细胞克隆动物,但后者克隆动物的成功率较低,易出现严重的免疫功能缺陷和突变。老鼠的胚胎干细胞中能产生出精、卵细胞,并能成功受精甚至可以从雌性和雄性细胞中培育出实验室卵细胞,将促进生殖和克隆的研究。

2.1.2用于发育生物学研究

哺乳动物早期胚胎的体积很小,又在子宫内发育,要想在体内研究细胞分化及其机理几乎是不可能的,而干细胞特别是ES细胞具有独特的发育全能性,在特定的体外培养条件和诱导剂的共同作用下经过若干前体细胞阶段,可分化为神经、肌肉、软骨、血细胞、上皮细胞和成纤维细胞等。因此ES细胞是研究特定类型细胞分化的模型、探索某些前体细胞起源和细胞谱系演变的较为理想的实验体系。应用基因芯片等生物技术比较ES细胞不同发育阶段细胞的基因转录和表达,不仅可确定胚胎发育及细胞分化的分子机制,还可发现新的基因。借助基因打靶技术,通过囊胚注射制作嵌合体的途径,将外源基因引入受体基因库,可在整体水平上研究高等动物的基因表达、调控和生理功能,同时也会为阐明胚胎发育中基因表达的时空关系提供手段。

2.1.3用于新型药物研究和组织器官的修复、治疗研究

ES细胞提供了新药的药理、毒理及药物代谢等细胞水平的研究手段。既减少了药物实验所需的动物数量,又便于找到有效和持久的治疗方法。无论采取自体或异体移植来修复缺损组织和器官,都受到客观条件的限制,特别是种子细胞的来源不足。

利用基因打靶技术使外源性DNA 与胚胎干细胞中的相应部分重组, 或靶向破坏等位基因造成基因纯合失效来治疗某些遗传性疾病, 具有基因转移效率高、易于操作的优点。

新药在临床使用前需要进行一系列的检测和实验, 这些实验都依靠动物来完成。但是动物模型实验不可能完全反映药物对人体细胞的作用。胚胎干细胞或许能模拟体内细胞或组织对被检测药物的反应, 从而提供更安全、更有效、更经济的药物筛选模型。

大量动物研究显示,胚胎来源的干细胞在神经缺损和慢性去神经支配的模型中也表现出良好的再生和修复作用。

2.2 iPSs 的应用 随着 iPSs 相关研究的发展,人们更关注的是其临床应用的潜能、安全性和可靠性。iPSs 不仅可用于细胞移植,器官再生,特别是细胞损伤、坏死严重的疾病的细胞移植治疗;还可以构建疾病模型,以便于研究疾病形成的机制、发生发展及转归,筛选新的药物,以及研究新的治疗方法。Jaenisch 小组[64]建立了鼠镰刀状红细胞贫血症模型,接着将小鼠成纤维细胞诱导为 iPS 细胞,并使其定向分化为造血前体细胞,细胞移植发现 iPSs 来源的造血前体细胞能够成功治疗镰状红细胞贫血;Takayama 研究小组[65]首次成功用人类 iPSs 培养出血小板,虽然用 iPSs 培养血小板的效率很低,但是生成的血小板的大小、形状和功能都与内源性血小板类似,据研究人员称这项研究成果表明,从技术上来说,用 iPSs 培育人类红细胞和白细胞都是可能的,而且 iPSs 培养出来的血小板在未来几年内极有可能开始临床试验。另有研究小组用从 iPSs 诱导来的内皮前体细胞和内皮细胞成功地治疗了血友病 A[66]。这些从理论和实践上为人类单基因遗传病治疗奠定了基础。 Wernig 小组[67]通过研究不仅发现将鼠 iPSs 分化的神经前体细胞移植入胎鼠脑中,细胞可以迁移并分化为谷氨酰胺能神经元、γ-氨基丁酸能神经元、儿茶酚胺能神经元等神经胶质细胞和神经元细胞。而且将鼠iPSs 诱导为多巴胺能神经元移植进帕金森病(PD)疾病模型体内,可有效缓解其症状和改善其行为。后来该小组又将移除外源基因的人 iPSs 成功诱导成多巴胺神经元[44]。Dimos 小组[68]也从一位 82 岁的肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)女性患者体细胞中制备了疾病特异的 iPSs,并可在体外定向诱导分化为运动神经元。该成果说明 iPSs 对复杂疾病治疗的可能性,为帕金森氏病和肌萎缩性脊髓侧索硬化症患者带来了福音。Park 等[38]从患有遗传病患者的成纤维细胞中诱导得到了疾病特异性 iPSs,这些遗传病包括与腺苷脱氨酶缺乏相关的重度联合免疫缺陷症、Shwachman- Bodian-Diamond 综合征、Ⅲ 型高雪症、杜显/贝克肌肉萎缩症、帕金森病、亨廷顿舞蹈症、1 型糖尿病、21 三体综合征、Lesch-Nyhan 综合征基因携带者。患者体细胞重编程为疾病特异性的细胞能避免普通干细胞移植的免疫排斥反应,也将解决目前细胞移植的来源限制问题。 Ebert 等[69]从一脊髓性肌萎缩(SMA)小孩患者身上取下皮肤成纤维细胞,借助慢病毒载体将 Oct4,Sox2, Nanog 和 Lin28 导入细胞得到 iPSs。该 iPSs 来源的疾病特异性运动神经元表现出与正常运动神经元不同的基因型变化,为脊髓损伤(SCI)、SMA 等神经系统退行性疾病指明一种新的治疗方向。

2.3 成体干细胞的应用

2.3.1 HSC的应用

造血干细胞(HSC)是体内各种血细胞的唯一来源,成体内的主要存在于骨髓中,外周血中也有。目前,HSC已广泛用于白血病的治疗有数据显示,国际上应用HSC移植联合化疗治疗急性淋巴细胞白血病的5年无病生存率约为80%,个别治疗中心可达90%,而急性非淋巴白血病也可达40%左右,此外对放、化疗敏感的晚期癌症患者或常规治疗无效、复发或高度恶性的癌症患者,可先用超大剂量的放化疗,最大限度的清除患者体内的癌细胞,然后移植HSC重建被破坏的造血系统和免疫系统,这种联合治疗已经成功应用于乳腺癌、神经母细胞瘤等恶性疾病的治疗。还应用于慢性肝炎等一系列疾病的治疗中。

2.3.2MSC的应用

间充质干细胞( MSC)是一类来源于中胚层的具有自我更新及多向分化潜能的干细胞,在体外能够分化为多种细胞,如骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等。其的研究相比HSC的研究起步较晚,但发展很快。研究发现MSC可以定向归巢到病变组织并在病变组织中存活和增殖。在体外对MSC进行基因修饰后注入体内能够归巢到病变组织而杀死病变组织的细胞。这一特点使MSC成为了细胞治疗的极好的载体。

除此,MSC对难治性移植物抗宿主病(GVHD)具有很大应用价值。MSC具有免疫调节作用,能抑制GVHD,可用于自身免疫疾病的治疗;MSC分化的软骨细胞具有与MSC共同的特性;MSC可以通过表达成骨及血管生成因子协同促进修复骨缺损;MSC还可以减轻炎症反应;由于骨髓源性的MSC能够阻止肝纤维化进展,使得MSC可以应用于治疗肝硬化;MSC可以使新血管生成增加,心肌再生,因此异体人MSC可以应用于急性心肌梗死等心脑血管疾病;MSC移植可使神经细胞再生和神经结构重建,恢复损伤的神经功能,使其成为治疗神经系统疾病理想的种子细胞;化疗后病人骨髓MSC增殖能力、粘附性及分泌白介素及干细胞生长因子的能力均下降,因此MSC对于辅助化疗的病人具有潜在临床应用价值。除以上应用外MSC在支持造血干细胞体外扩增及治疗面部皱纹等方面亦取得一定效果。治疗糖尿病、肾病等疾病的研究正在进行中。还可治疗克罗恩病、成骨不全、软骨损伤、脊髓损伤等疾病。

2.3.3其他干细胞的应用

神经干细胞及精原干细胞由于其发生部位限制了其广泛应用,但其用于治疗特定部位引起的组织特异性疾病功效十分显著。神经干细胞也用于治疗脑梗塞、帕金森等神经系统及脑组织病变引发的疾病。精原干细胞主要用于男性不育方面。

参考文献:

[1] 李敏.干细胞研究进展及其应用探讨.绿色科技.2012(5).

[2] 王格.诱导多功能干细胞的研究进展.中国组织工程研究与临床康复.第15卷第23期2011–06–04.

[3] 刘国强.魏蕊.洪天配.干细胞移植治疗糖尿病的研究进展. 《中国医学前沿杂志(电子版)》2014 年第 6 卷第 1 期

[4] 李芳兰.张国贞.人胚胎干细胞研究现状及其应用前景.中国组织工程研究与临床康复.第二卷第3期 2007-01-21.

[5] 朱丽华.干细胞研究进展消息.中国细胞生物学学报2010,32(6):955一988.

[6] 王海涛等.干细胞治疗周围神经损伤研究进展. 现代生物医学进展.2014.2.

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